BAB I
STERILISASI
Pengertian
Sterilisasi
yaitu proses atau kegiatan membebaskan suatu bahan atau benda dari semua bentuk
kehidupan terutama mikroorganisme.
Macam-macam sterilisasi
Pada
prinsipnya sterilisasi dapat dilakukan dengan 3 cara yaitu secara mekanik,
fisik dan kimiawi.
1.
Sterilisai
secara mekanik (filtrasi) menggunakan suatu saringan yang berpori sangat kecil
(0.22 mikron atau 0.45 mikron) sehingga mikroba tertahan pada saringan
tersebut. Proses ini ditujukan untuk sterilisasi bahan yang peka panas, misal
nya larutan enzim dan antibiotik.
2.
Sterilisasi
secara fisik dapat dilakukan dengan pemanasan & penyinaran.
A,
Pemanasan
a. Pemijaran (dengan api langsung):
membakar alat pada api secara langsung, contoh alat : jarum inokulum, pinset,
batang L, dll.
b. Panas kering: sterilisasi dengan
oven kira-kira 60-1800C. Sterilisasi panas kering cocok untuk alat
yang terbuat dari kaca misalnya erlenmeyer, tabung reaksi dll.
c. Uap air panas: konsep ini mirip
dengan mengukus. Bahan yang mengandung air lebih tepat menggungakan metode ini
supaya tidak terjadi dehidrasi.
d. Uap air panas bertekanan :
menggunalkan autoklaf
e. Sinar Ultra Violet juga dapat digunakan
untuk proses sterilisasi, misalnya untuk membunuh mikroba yang menempel pada
permukaan interior Safety Cabinet dengan disinari lampu UV
3.
Sterilisaisi
secara kimiawi biasanya menggunakan senyawa desinfektan antara lain alkohol.
ANTISEPTIK KIMIA
Antiseptik biasanya dipergunakan dan dibiarkan menguap
seperti halnya alkohol. Umumnya isoptropil alkohol 70-90% adalah yang termurah
namun merupakan antiseptik yang sangat efektif. Penambahan yodium pada alkohol
akan meningkatkan daya disenfektannya dan jika tampa yodium isoptropil alkohol
tidak efektip terhadap spora,solusi terbaik untuk membunuh spora adalah
campuran formaldehid dengan alkohol,tetapi solusi ini terlalu toksik untuk
dipakai sebagai antiseptik. Oleh karena solusi disenfektan atau gas tidak perlu
berkontraksi dengan kulit manusia atua membran mukosa maka toksis yang lebih
tinggi masih dapat diterima sehingga mereka dapat dipakai sebagai bahan-bahan
antimikroba
HALOGEN
Halogen meliputi senyawa-senyawa klorin dan yodium, baik
yang organik maupun inorganik. Kebanyakan senyawa halogen mebunuh sel hidup.
Mereka membunuh sel karena mengoksidasi protein dan dengan demikian merusak
membran dan menginaktifkan ensim-ensim.
YODIUM
Solusi yodium baik dalam air maupun dalam alkohol
bersifat sangat antiseptik dan telah dipakai sejak lama sebagai antiseptik
kulit sebelum proses pembedahan, yodium juga efektip terhadap berbagai protosoa
seperti misalnya amuba yang menyebabkan disetri,dan tidak mengganggu kulit
namun penggunaan tinturayodii mewarnai jaringan dan menyebabkan iritasi lokal
pada kulit, dan kadang-kadang reaksi alergi.
KLORIN
Klorin bebas memiliki warna khas (hijau) dan bau yang
tajam. Sudah sejak lama klorin dikenal seagai deodoran dan disenfektan yang
sangat baik dan dijadikan standar pengolahan air minum diseluruh lingkungan.
Namun senyawa klorin diinaktifkan oleh bahan-bahan organik dan beberapa
katalisator logam.dan hipoklorit paling banyak digunakan untuk maksud
disenfeksi dan menghilangkan bau karena sifatnya tidak berbahaya bagi jaringan manusia,mudah
ditangani,tidak berwarna,tidak mewarnai.digunakan dirumah sakit sebagai
disenfeksi alat-alat medis,air yang dikhawatirkan tercemar biasanya
dipergunakan lazom atau parasulfone
dicloramidobenzuic acid yang konsentrasinya 4-8 mgr/L dapat mendisenfeksi
air yang mengandung salmonella typhi dalam
waktu 3 menit.
ALKOHOL
Alkohl merupaan zat yang paling efetif dan dapat
diandalkan untuk sterilisasi dan disefeksi. Alkohl mendenaturasi protein dengan
jalan dehidrasi, dan juga merupakan pelarat lemak, oleh karenanya membran sel
akan rusak dan ensim-ensim akan diinaktifkan oleh alkohol. Ada 3 jenis alkohol
dipergunakan yaitu metanol, CH3 OH,atenol, CH3CH2OH,
isoprapanol (CH3)2 CHOH. Menurut ketentuan semakin tinggi
berat molekulnya semakin meningkat pula daya baktrisidnya.diantara 3 jenis
alkohol yang banyak digunakan adalah isopropil. Jika alkohol 70-80% dalam air
maka konsetrasinya 90% ataua dibawah 50% bisanya kurang efektif sampai
konsentrasi 99% waktu 10 menit sudah cukup membunuh sel vegetatif tetapi spora
tidak. Aolkohol sering dipakia diesnfektan kulit baik cmpuran maupun sendiri.
FENOL
Fenol (asam karbol) untuk
pertama kalinya dipergunakan Lister didalam ruangan bedah sebagai germicide untuk mencegah timbulnya
infeksi pasca bedah. Fenol mempresipitasikan protein secara aktif dan selain
itu juga merusa membran sel dengan menurunkan tegangan fenil dan kresol berbau
khas dan bersifat korosit terhadap jaringan namun tahan terhadap pamanasan dan
pengeringanserta tidak terpengaruh oleh bahan-bahan organik,tetapi kurang
efektik untuk spora. Penambahan haligen seperti klorin akan meningkatan
aktifitas fenol. Heksakklorofen merupakan derivat fenol yang paling berguna,
dan dikombinasikan dengan sabun akan merupakan disenfetan kulit yang sangat
efetif tetapi lambat kerjanya. Fenol dan kresol juga bersifat menghilangkan
sakit (pain killing) oleh karena
toksik mereka hanya dapat dipergunakan secara ekternal.
PEROKSIDA
Perosida hidrogen ( H2O2)
merupakan antiseptik yang efektif dan nontoksik. Molekulnya tidak stabil dan
apabiladipanaskan akan terurai menjadi air dan oksigen. Rumus 2 H2 O2
à 2 H2O+ O2.dengan
dadnya ion-ion logam yang umunya terdapat didalam stoplasma sel, maka selama
pembentukan oksigen dibentuk pula radikal superoksida (O2-)bemuatan
negatif didalam protein dan mengaktifkan sitem enzim yang vital. Pada
konsentrasi 0,3,6,0%, H2O2 dipaki untuk disenfeksi dan
pada kosentrasi 6,0,-25,0 % dipakai untuk sterilisasi. Pada konsentrasi 0,1 %
didalam susu pada suhu 54 oC selama 3 menit, H2O2
dapat mengurangi jumlah kuman sampai 99,99 % dan terdapat bukti H2O2
10% bersifet virusid dan sporosid, larutan 3% biasanya dipakai untuk mencuci
luka karena kuman anaerop terutama sangat peka terhadap oksigen. Pasta Na2O2
dipakai mengobati akne, sedangkan ZnO2 untuk mengobati infeksi kulit
karena kuman-kuman anaerob dan mikroaerofilik.
MACAM-MACAM BAHAN DAN CARA STERILISASI










Berbagai
prosedur umum kerja dalam mikrobiologi yang membutuhkan teknik aseptis
Desinfeksi meja kerja
3
4
6
Saran-saran kerja aseptis :
1.
Sebelum
membuka ruangan atau bagian steril di dalam tabung/cawan/erlenmeyer sebaiknya
bagian mulut (bagian yang memungkinkan kontaminan masuk) dibakar/dilewatkan api
terlebih dahulu.
2.
Pinset,
batang L, dll dapat disemprot dengan alkohol terlebih dahulu lalu dibakar.
3.
Ujung
jarum inokulum yang sudah dipijarkan harus ditunggu dingin dahulu atau dapat
ditempelkan tutup cawan bagian dalam untuk mempercepat transfer panas yang
terjadi.
4.
Usahakan
bagian alat yang diharapkan dalam kondisi steril didekatkan ke bagian api.
5.
Jika
kerja di Safety Cabinet tidak perlu memakai
pembakar bunsen tetapi jika di luar Safety Cabinet maka semakin banyak sumber
api maka semakin terjamin kondisi aseptisnya
Uraian lebih lanjut mengenai dasar teknik aspetis dapat
dibaca DISINI
Prinsip cara kerja autoklaf
Seperti yang telah dijelaskan sebagian pada bab pengenalan
alat, autoklaf adalah alat untuk memsterilkan berbagai macam alat & bahan
yang menggunakan tekanan 15 psi (1,02 atm) dan suhu 1210C. Untuk
cara kerja penggunaan autoklaf telah disampaikan di depan. Suhu dan tekanan
tinggi yang diberikan kepada alat dan media yang disterilisasi memberikan
kekuatan yang lebih besar untuk membunuh sel dibanding dengan udara panas.
Biasanya untuk mesterilkan media digunakan suhu 1210C dan tekanan 15
lb/in2 (SI = 103,4 Kpa) selama 15 menit. Alasan digunakan suhu
1210C atau 249,8 0F adalah karena air mendidih pada
suhu tersebut jika digunakan tekanan 15 psi. Untuk tekanan 0 psi pada
ketinggian di permukaan laut (sea level) air mendidih pada suhu 1000C,
sedangkan untuk autoklaf yang diletakkan di ketinggian sama, menggunakan
tekanan 15 psi maka air akan memdididh pada suhu 1210C. Ingat
kejadian ini hanya berlaku untuk sea level, jika dilaboratorium terletak pada
ketinggian tertentu, maka pengaturan tekanan perlu disetting ulang. Misalnya
autoklaf diletakkan pada ketinggian 2700 kaki dpl, maka tekanan dinaikkan
menjadi 20 psi supaya tercapai suhu 1210C untuk mendidihkan air.
Semua bentuk kehidupan akan mati jika dididihkan pada suhu 1210C dan
tekanan 15 psi selama 15 menit.
Pada saat sumber panas dinyalakan,
air dalam autoklaf lama kelamaan akan mendidih dan uap air yang terbentuk
mendesak udara yang mengisi autoklaf. Setelah semua udara dalam autoklaf
diganti dengan uap air, katup uap/udara ditutup sehingga tekanan udara dalam
autoklaf naik. Pada saat tercapai tekanan dan suhu yang sesuai., maka proses
sterilisasi
dimulai dan timer mulai menghitung waktu
mundur. Setelah proses sterilisasi selesai, sumber panas dimatikan dan tekanan
dibiarkan turun perlahan hingga mencapai 0 psi. Autoklaf tidak boleh dibuka
sebelum tekanan mencapai 0 psi.
Untuk mendeteksi bahwa autoklaf bekerja dengan sempurna
dapat digunakan mikroba pengguji yang bersifat termofilik dan memiliki
endospora yaitu Bacillus stearothermophillus, lazimnya mikroba ini
tersedia secara komersial dalam bentuk spore strip. Kertas spore
strip ini dimasukkan dalam autoklaf dan disterilkan. Setelah proses
sterilisai lalu ditumbuhkan pada media. Jika media tetap bening maka
menunjukkan autoklaf telah bekerja dengan baik.
Beberapa media atau bahan yang tidak disterilkan dengan
autoklaf adalah :
- Bahan tidak tahan panas seperti serum, vitamin,
antibiotik, dan enzim
- Paelarut organik, seperti fenol
- Buffer engan kandungan detergen, seperti SDS
Untuk mencegah terjadinya presipitasi, pencoklatan (media
menjadi coklat) dan hancurnya substrat dapat dilakukan pencegahan sbb :
§ Glukosa disterilkan terpisah dengan
asam amino (peptone) atau senyawa fosfat
§ Senyawa fosfat disterilkan terpisah
dengan asam amino (peptone) atau senyawa garam mineral lain.
§ Senyawa garam mineral disterilkan
terpisah dengan agar
§ Media yang memiliki pH > 7,5
jangan disterilkan dengan autoklaf
§ Jangan mensterilisasi larutan agar
dengan pH < 6,0
Erlenmeyer hanya boleh diisi media maksimum ¾ dari total
volumenya, sisa ruang dibirkan kosong. Jika mensterilkan media 1L yang
ditampung pada erlenmeyer 2L maka sterilisasi diatur dengan waktu 30 menit.
Sterilisasi dengan penyaringan (filtrasi)
Sterilisasi dengan penyaringan dilakukan untuk
mensterilisasi cairan yagn mudah rusak jika terkena panas atu mudah menguap (volatile).
Cairan yang disterilisasi dilewatkan ke suatu saringan (ditekan dengan gaya
sentrifugasi atau pompa vakum) yang berpori dengan diameter yang cukup kecil
untuk menyaring bakteri. Virus tidak akan tersaring dengan metode ini.
Sterilisasi dengan penyaringan dapat
dilakukan dengan berbagai cara :
· Non-disposable filtration apparatus
- Disedot dengan pompa vakum
- Volume 20-1000 ml
· Disposable filter cup unit
- Disedot dengan pompa vakum
- Volume 15-1000 ml
· Disposable filtration unit dengan botol
penyimpan
- Disedot dengan pompa vakum
- Volume 15-1000 ml
· Syringe filters
- Ditekan seperti jarum suntik
- Volume 1-20 ml
· Spin filters
- Ditekan dengan gaya setrifugasi
- Volume kurang dari 1 ml
Cara kerja menggunakan Non-disposable filtration
apparatus



Setelah semua larutan melewati membran filter dan tertampung
dierlenmeyer, maka larutan dapat dipindahkan kedalam gelas penampung lain yang
sudah steril dan tutup dengan kapas atau aluminium foil yang steril.Bacaan
lebih lanjut mengenai teknik filtrasi untuk menghitung mikroorganisme dapat
dibaca di sini
Tyndalisasi
Konsep kerja metode ini merip dengan mengukus. Bahan yang
mengandung air dan tidak tahan tekanan atau suhu tinggi lebih tepat disterilkan
dengan metode ini. Misalnya susu yang disterilkan dengan suhu tinggi akan
mengalami koagulasi dan bahan yang berpati disterilkan pada suhu bertekanan
pada kondisi pH asam akan terhidrolisis.
Cara kerja :
o
Bahan
dimasukkan kedalam erlenmeyer atau botol dan ditutup rapat dengan sumbat atau
aluminium foil.
o
Erlenmeyer/botol
lalu dimasukkan kedalam alat sterilisasi (alat standar menggunakan Arnold
Steam Sterilizen atau dandang).
o
Nyalakan
sumber panas dan tunggu hingga termometer menunjukkan suhu 1000C
kemudian hitung waktu mundur hingga 30 menit (uap panas yang terbentuk akan
mematikan mikroba).
o
Setelah
selesai alat sterilisasi dimatikan dan bahan yang steril dikeluarkan.
o
Setelah
24 jam, bahan tersebut di sterilkan lagi dengan cara yang sama, sedang waktu
ini dimaksudkan untuk memberi kesempatan spora atau sel vegetatif yang belum
mati untuk tumbuh sehingga mudah dibunuh.
Sterilisasi dengan udara panas (Dry heat sterilization)
Sterilisasi
dengan metode ini biasanya digunakan untuk peralatan gelas seperti cawan petri,
pipet ukur dan labu erlenmyer. Alat gelas yang disterilisasi dengan udara panas
tidak akan timbul kondensasi sehingga tidak ada tetes air (embun) didalam alat
gelas.
o
Bungkus
alat-alat gelas dengan kertas payung atau aluminium foil
o
Atur
pengatur suhu oven menjadi 1800C dan alat disterilkan selama 2-3
jam.
Prinsip kerja Biological Saferty Cabinet
Biological Safety Cabinet merupakan kabinet kerja yang sterilkan untuk kerja
mikrobiologi. BSC memiliki suatu pengatur aliran udara yang menciptakan aliran
udara kotor (dimungkinkan ada kontaminan) untuk disaring dan diresirkulasi
melalui filter.
BSC juga disebut biosafety hood, dan juga
dikenal dengan Laminar flow hood atau Class
II vertical flow cabinet yang menyediakan alat filtrasi dan aliran
udara yang bersirkulasi didalam ruang kerja. Aliran udara diatur untuk
menghambat udara luar masuk dan udara di dalam keluar, untuk mencegah
kontaminasi dari luar dan pencemaran bakteri dari ruang BSC. Udara yang keluar
disaring melewati penyaring sehingga sel-sel yang berbahaya tidak lepas keluar
ke ruangan lain.
Berbagai kelas Biological Safety Cabinet.
BSC yang dimiliki Lab mikrobiologi
merupakan BSC kelas II yang memiliki konfigurasi udara seperti gambar disamping
ini. Udara yang berasal dari luar kabinet akan langsung terserap masuk
kesaluran bawah yang bergabung dengan udara dari meja kerja yang dimungkinkan
mengandung bakteri yang digunakan untuk kerja. Udara dari meja kerja disedot
dari depan meja kerja. Kemudian udara kotor ini disaring oleh penyaring HEPA
dan disirkulasikan keluar kabinet atau kembali lagi ke meja kerja sebagai udara
bersih.